微生物是地球上最为丰富且分布最为广泛的生命形式，在生态系统中对有机物的生物地球化学循环发挥关键作用。微生物降解在有机污染物分解中是至关重要的环节，其中，降解功能微生物能够将污染物高效转化为无毒化合物，是有机污染物降解的主要执行者。因此，深入研究原位降解功能微生物的种类和代谢特性，从复杂环境微生物群落中挖掘具有“特定代谢功能”的活体菌株资源，以提升有机污染物去除效率，一直是业界长期追求的目标，也是环境微生物研究的焦点和难点。传统的DNA-稳定同位素探针（DNA-SIP）技术能够识别真实环境中发挥降解作用的功能微生物。然而，该技术只能获取功能微生物的部分DNA信息，从群落水平上解析其物种组成，难以做到单一功能微生物的分离和培养，也无法深入研究功能基因和代谢通路，限制了这些具有降解功能的微生物在环境污染治理中的应用。因此，我们以石油烃中的多环芳烃（PAHs）和BETX为模型化合物，基于SIP技术，发展了两种新技术，以探究土壤中原位石油烃降解功能微生物。首先，我们将磁性纳米颗粒介导分离技术（MMI）、DNA-SIP和单细胞拉曼分选（RACS）技术联用，研发了MMI-SIP-RACS技术。以石油污染土壤中的PAHs为研究对象，运用MMI技术对降解功能微生物细胞进行富集，借助SIP和RACS技术锁定和分离目标微生物细胞，并进一步在单细胞水平上探索了这些细胞的遗传特征及降解机制。结果显示：MMI-SIP-RACS显著富集了PAHs降解菌，并有效分离出具有代表性的功能微生物单细胞；综合SIP扩增子测序、拉曼光谱中单细胞的¹³C移位及单细胞基因组测序结果，证实新鞘脂菌（Novosphingobium sp.）是参与土壤中原位降解PAHs的功能微生物；成功重建了Novosphingobium微生物细胞的菲代谢途径，解析了菲双加氧酶（Phn）、萘双加氧酶（Nah）基因等多个新型PAHs降解基因。
随后，为了实现目标功能微生物的培养，我们将SIP-RACS和反向基因组学（GDC：基因组指导微生物培养）技术联用，发展了RACS-SIP-GDC技术。以石油污染土壤中的BTEX为研究对象，从复杂的石油污染土壤微生物群落中鉴定、分离和培养活性甲苯降解菌。通过SIP-RACS，识别并分选出单个功能微生物细胞；随后，基于单细胞的基因组分析，根据功能微生物的代谢特性，反向推导出功能微生物对生长条件的需求，并通过添加抗生素、氨基酸、碳源和生长因子等对传统培养基进行修改，成功培养了RACS分选的活性降解菌Pigmentiphaga sp.
我们研发了MMI-SIP-RACS和RACS-SIP-GDC新方法，实现了单细胞水平上对石油烃降解微生物的原位富集、精准识别、定向分离和培养，可为有效分离和培养真实环境中有机污染物降解微生物细胞提供技术支撑。同时，该技术将降解功能微生物与功能基因和代谢通路直接关联，为研究有机污染物生物降解机制提供了新思路。

稳定同位素探针,代谢通路,单细胞拉曼分选,降解菌,反向基因组学